眾所周知，直接觀察的光學顯微鏡對細胞生物學、發育生物學、免疫學、病理藥理學等生物醫學研究具有重要意義。但受到衍射極限的限制，傳統光學顯微鏡的分辨率理論上只能達到光波長的一半。較長時間以來，超分辨熒光顯微成像技術的出現有效打破了光學衍射極限的束縛。基于單分子定位技術的超分辨顯微鏡（SMLM）和受激發射損耗顯微鏡（STED）以及結構光照明超分辨顯微鏡（SIM）等技術在眾多課題組的努力下都得到了長足發展，尤其是結構光照明顯微鏡具有成像速度快、光毒性小、無須特殊熒光標記等優勢，已成為生命科學領域尤其是活細胞成像中很受歡迎的一種技術手段。近期，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所李輝課題組圍繞結構光照明超分辨顯微成像方法、高保真SIM重構算法、國產化的SIM顯微鏡研制等研究，取得了一系列重要進展。
三維成像方法因能夠獲取更多的生物樣品信息而備受關注。然而，現有的三維成像不可避免地帶來離焦模糊和時間分辨率差的問題，不易用于對樣品的快速三維動態成像。為了實現對厚樣品的快速三維成像，李輝課題組發展出基于數字微鏡陣列器件（DMD）和液體變焦透鏡（ETL）的結構光照明層切顯微技術，并開發出基于兩張原始圖像的層切成像算法。該方法將傳統的三維層切成像的速度提高了數倍以上，課題組利用該技術，對斑馬魚和大腦血管的心血管系統進行了高速動態成像，清晰地顯示了心臟跳動期的收縮-舒張過程以及腹部血管的蠕動特性。相關研究成果以Four-dimensional
visualization of zebrafish cardiovascular and vessel dynamics by a
structured illumination microscope with electrically tunable lens為題，發表在Biomedical Optical Express（2020）上，其中，博士生陳沖為論文第一作者。
圖1 基于兩張正反圖像的結構光照明層切算法（左）；斑馬魚心臟跳動過程的快速三維成像（右）
結構光照明超分辨成像技術在多種納米尺度的亞細胞結構研究中已得到廣泛應用，但對于具有大動態范圍的樣本（如聚集的細胞囊泡），樣品中熒光較強的聚集性區域和亮度較弱的稀疏區域不能同時呈現。現有的SIM方法針對這種樣品無法重建出高質量的圖像。對此，李輝課題組提出了一種采用多重曝光采集的高動態SIM成像方法HDR-SIM，采集三組不同強度照明的SIM圖像，然后融合出一幀超分辨圖像。利用HDR-SIM，強度相差400多倍單個和聚集的熒光小球樣本在同一張SIM超分辨圖中可同時觀察到，并且對分辨率不會產生影響。在使用該方法觀測不同尺度的細胞囊泡結構時，單個小囊泡和大的囊泡聚集均可同時獲得清晰的分辨。相關研究成果以High Dynamic Range Structured Illumination Microscope Based on Multiple Exposures為題，發表在Frontiers in Physics（2021）上，其中，梁永為論文第一作者。
圖2 高動態SIM成像原理（左）；“聚集-單個”的熒光小球高動態SIM成像（右）
在結構光照明成像過程中，超分辨圖像重建算法尤為關鍵。SIM重建算法的一些固有缺陷造成超分辨圖像中常出現重構偽影，使SIM圖像的保真度經常受到質疑，并且圖像重建時需要完成一系列復雜的參數設定，限制著普通用戶對SIM技術應用。李輝課題組開發出一種基于點頻譜優化的高保真SIM重建算法。該算法克服了常規SIM算法易產生重構偽影且光學層切能力差的問題，對不同質量原始數據的處理均能獲得具有極少偽影和良好光學層切的高質量超分辨圖像，有效提高了SIM成像的保真度。同時，該算法對OTF失配和用戶自定義參數不敏感，使用生成的理論OTF和較少的參數即可重構高質量SIM圖像，降低了SIM成像對實驗實施和后處理重構的高要求，提升了算法對普通用戶的友好度。相較于幾種傳統的SIM算法，HiFi-SIM算法對多種不同圖像質量、不同樣品復雜度、不同圖像來源（商用設備/自主搭建SIM系統）的原始數據進行重建, HiFi-SIM均展現出最少的重建偽影和最優的圖像質量。相關研究成果以High-fidelity structured illumination microscopy by point-spread-function engineering為題，發表Light: Science & Applications（2021）上，其中，文剛為論文第一作者。
圖3 高保真結構光照明超分辨成像重建算法HiFi-SIM（左）；細胞結構HiFi-SIM與其他算法重建結果比較（右）
李輝課題組自2014年以來一直專注于SIM成像的技術創新、儀器研發和應用推廣，開發出多種形式的結構光照明顯微鏡系統。近期，基于課題組最新的研究成果，研發出一套可集成于顯微鏡下層光路的結構光照明插件，具有結構緊湊、方便易用等特點。插件可配置國產倒置熒光顯微鏡，實現了SIM超分辨成像系統的國產化替代。首臺機器已于近期交付某大學用戶進行試用。
圖4 插件式結構光照明超分辨成像系統
以上工作獲得國家重點研發計劃項目和國家自然科學基金委項目的支持。
