使用傳統的硅-玻璃體系能夠以各種方式制備微流控芯片，易于硅加工和表面修飾，并且有利于后續應用，例如細胞接種及相關研究。目前，細胞的熒光成像成為研究細胞行為的標準技術。不幸的是，硅流道底部的不均勻表面影響了通過濾光片的光穿透，致使微流控系統中的高靈敏度熒光成像（例如使用全內反射熒光（TIRF）顯微鏡）出現問題。
據麥姆斯咨詢報道，西北工業大學聯合捷克科學院（Czech Academy of Science）生物技術研究所（Institute of Biotechnology）及查理大學（Charles University）針對上述問題做了進一步研究，他們發現可以使用絕緣體上硅（SOI）襯底，通過頂部硅層的厚度定義流道深度，以及停止掩埋二氧化硅（SiO2）層的蝕刻來解決這一問題。如此，熒光背景信號下降到原來的五分之一，對應的熒光素檢測限從?0.05毫摩爾提升到?50納摩爾。研究人員證明了使用基于全內反射熒光的單分子檢測平坦表面的重要性，與傳統的硅晶圓相比，其信噪比提高了超18倍。
典型的熒光光學系統包括：光源、激發濾光片（XF，用于防止不需要的成分激發光并可能干擾結果）、二向色鏡（DM，又稱雙色鏡，用于在樣品上反射經濾光的激發光），以及一個發射濾光片（MF，用于阻擋濾過的激發光），該系統只允許發射光通過光學探測器，該探測器可以是光電二極管、光電倍增管（PMT）或合適的相機。研究人員使用了高端濾光片，ET系列型號49002（產自美國佛蒙特州貝洛斯福爾斯的Chroma Technology公司），用于異硫氰酸熒光素（FITC）型熒光。
（A）異硫氰酸熒光素（FITC）濾光片組透射圖，展示激發濾光片（藍色）、二向色鏡（紅色）和發射濾片（綠色）的特性；（B）使用異硫氰酸熒光素濾光片組的Stilla數字聚合酶鏈式反應（PCR）芯片的熒光圖像
研究人員使用納米光刻工具箱設計微流控芯片（下圖A），它有16個帶有切向管連接的腔室，每個腔室的面積為15mm2，深度為?100μm，體積為1.5nL，并使用計算機輔助軟件可視化單個腔室（下圖B）。他們使用傳統的微制造技術用于微流控芯片，包括使用兩個光刻步驟的圖案化硅襯底和陽極鍵合到硅襯底的非圖案化玻璃蓋。他們在平坦襯底上進行了兩次光刻步驟，這對他們來說，沒有任何挑戰。接著，他們使用博世（Bosch）工藝和基于六氟化硫（SF6）蝕刻和八氟異丁烯（C4F8）聚合物沉積結合的深反應離子蝕刻（DRIE）。這是一種眾所周知的工藝，蝕刻速率極佳。然后，他們使用陽極鍵合對蝕刻的硅晶片進行封蓋，因為玻璃基板上沒有圖案，這意味著不必遵守嚴格的對準規則，這是一項容易的制造任務。
基于不同表面的微加工工藝展示
研究人員將兩個微流控芯片置于光學顯微鏡下，并捕獲了兩個硅襯底的暗場圖像，一個由傳統硅晶圓制成（下圖A1），另一個由SOI晶圓制成（下圖A2）。他們觀察到了傳統硅晶圓制作的腔室底部的強光散射信號，而并沒有從基于SOI的腔室觀察到散射。正是這種散射導致了熒光的背景問題。他們使用基于配備50倍物鏡的Mireau干涉儀的白光光學剖面儀測量表面形貌?，使用垂直位移干涉模式（VSI）（下圖B1，B2）。硅襯底表面的粗糙度比SOI襯底大84倍。
（A）經20倍物鏡暗場顯微鏡蝕刻后的傳統硅襯底表面圖像；（B）垂直位移干涉模式下SOI襯底（上）與標準硅晶圓襯底（下）的干涉圖像；（C）光電倍增管電壓作為熒光素濃度的函數，腔室材料類型為參數，縱軸和橫軸使用對數刻度；紅色表示傳統的硅襯底，黑色表示SOI襯底。
研究人員將熒光素溶液填充進微流控芯片腔室，并將該溶液濃度從?1納摩爾改變至?100微摩爾，同時保持一個空腔作為參考，以確定每個芯片的熒光檢測限（LOD）。然后，他們測量了所有腔室的熒光振幅，并根據其繪制出熒光素濃度函數（上圖4C）?；跍y量，由傳統硅襯底制成的微流控芯片的熒光檢測限高出約5倍。
在該文章中，研究人員分析了使用微流控芯片進行單分子成像的高端濾光片的特性。
他們著重強調，結束微流控芯片的陽極鍵合之前的最后一個制造步驟是硅熱氧化，硅熱氧化在900°C下干燥的氧氣（O2）環境中進行，以生長厚度為5nm的二氧化硅（SiO2）層，同時確定腔室表面特性。該環境中的這一步驟去除了可能附著在原始硅表面的所有微量化學物質。硅以及用于陽極鍵合的玻璃都不顯示任何自熒光，并且硅和SOI這兩種不同襯底的微流控芯片之間的唯一區別是底部形貌，其余部分相同。因此，無論效果如何，根本原因是它與表面形貌有關，并且這種形貌的去除顯著改善了熒光測量（成像）特性。
研究人員發現，在使用硅襯底傳統技術制造微流控芯片時，由于與粗糙結構的底部相關的各種可能的影響，高分辨率成像（如用于單分子運動測定的全內反射熒光技術）并沒有達到預期的結果。他們研究了這一現象，并證明了用SOI襯底替代傳統硅襯底的解決方案，可保證微流控芯片的平坦底部，同時允許全內反射熒光技術通過使用488nm波長的照明來確定單分子運動性，從而最大限度地發揮其潛力。昂貴的SOI晶圓可能會被傳統的硅晶圓取代，并允許通過合適的平滑技術（例如基于氫氟酸（HF）/硝酸（HNO3）蝕刻技術）進行微流控腔室蝕刻。無論如何，與芯片制造相比，原始襯底的成本通常是相當低的，尤其是與包括單分子測試在內的后續應用相比，這證明了這種高襯底成本的合理性。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41598-022-23426-z
延伸閱讀：
《光譜成像市場和趨勢-2022版》
《微流控初創公司調研》
