美國波士頓大學程繼新課題組發明了短波紅外光熱顯微鏡。該技術實現了同時具有毫米穿透深度和微米空間分辨率的化學鍵振動成像，成功拍攝到深層生物組織內的高分辨脂質信息，為無創傷精準醫學診斷提供了新的途徑。
2024年6月25日，該成果以“Millimeter-deep micrometer-resolution vibrational imaging by shortwave infrared photothermal microscopy”為題發表于Nature Photonics期刊。博士生倪虹麗和博士后袁玉昊為該文章的共同第一作者。
在完整組織中探測細胞活動和功能對于癌癥病理學和藥物發現等生物醫學應用至關重要。振動顯微鏡通過提供營養物質、代謝產物和其他生物分子的化學對比度來研究細胞功能。然而，目前振動顯微鏡的成像深度不足以在不改變樣品的情況下分析出完好的類器官或組織中的化學成分。具體而言，基于紅外光譜的方法受限于水的強吸收，穿透深度被限制在數十微米內。自發或相干拉曼顯微鏡使用可見光或近紅外激發，但該波段組織散，成像深度同樣被限制在約100微米。通過探測漫反射光子，空間偏移拉曼光譜和自發拉曼斷層掃描可以獲取超過毫米深度的化學信息。然而，這些方法的空間分辨率在毫米級，并不能夠監測細胞級別大小的化學信息。短波紅外（波長從1000到2000納米）為深層組織成像打開了一個新的窗口，與可見光相比，其組織中的散射更弱，與中紅外相比，其水吸收更低。重要的是，分子振動基頻的倍頻信號正位于此窗口中，讓深層振動成像成為可能。各種短波紅外模式中，漫射光學斷層掃描可以在毫米級深度成像，但空間分辨率為毫米級。光聲成像因聲波在組織中弱散射而實現更高的空間分辨率。短波紅外光聲顯微鏡能夠對動脈組織和果蠅胚胎中的脂質進行振動成像。在短波紅外光聲顯微鏡中，因換能器放置于離信號源一定距離之外，聲信號在傳播過程中的損失降低了檢測靈敏度，并導致其只能檢測數十微米的目標。此外，聲耦合使光路設計復雜化，讓其不適用于如患者傷口之類的對接觸敏感的樣品。光學探測光聲顯微鏡可遠程感測目標，其激發波長已涵蓋短波紅外窗口。然而，光聲遠程感測的靈敏度不足以進行亞細胞化學成像。近日，波士頓大學程繼新課題組發明了短波紅外光熱（SWIP）顯微鏡用于亞細胞分辨率和毫米深度的組織成像。通過光學感測直接來自光吸收點的折射率變化，SWIP避免了傳播過程中的信號損失，消除了樣品接觸的必要性。通過泵浦探測方案，SWIP在強散射介質中達到了亞細胞空間分辨率和毫米級成像深度，即使透過800微米厚的散射假體依然能成像單個1微米的聚苯乙烯（PS）小球。此外，光熱衰減信號能夠在時間上區分周圍介質背景從而檢測到小物體。憑借這些進展，研究員展示了完整腫瘤球、厚動物組織切片和人類乳腺活檢中的細胞內脂質的SWIP三維成像。如圖1所示的泵浦探測顯微鏡，SWIP使用1725納米脈沖激光用于泵浦碳氫鍵振動的二倍頻吸收和1310納米連續激光用于探測。泵浦光和探測光合束聚焦到樣品上以測得吸收引起的光熱效應，即SWIP信號。其原理為熱調制的折射率形成一個微透鏡，進而改變探測激光的傳播，隨后通過改變收光鏡內光圈大小收集被調制的光強。2. SWIP顯微鏡的空間分辨率、化學選擇性及成像深度
如圖2所示，研究者使用SWIP顯微鏡成像單個500納米小球，提示SWIP的高靈敏度。系統的橫向和軸向分辨率分別為0.77微米和3.5微米。這樣的分辨率足以解析亞細胞特征。SWIP光譜與文獻中報道的短波紅外吸收光譜相符，表明SWIP具有化學選擇性。SWIP信號對激發功率和分子濃度呈現出線性依賴性。這些數據表明SWIP顯微鏡具有良好的靈敏度和線性分析能力。通過散射假體，研究者表征了SWIP顯微鏡的深度穿透和高分辨率成像能力。相比之下，使用相同條件的近紅外受激拉曼（SRS）成像，SRS圖像質量迅速下降。腫瘤球是比二維細胞培養更好的再現腫瘤生理的體外癌癥模型。由于癌癥的發展與脂質代謝的改變密切相關，細胞內脂質的成像有助于理解癌癥進展和測試藥物的有效性。然而，由于細胞密集排列導致的強散射，成像球內細胞成分十分具有挑戰性。為了克服強散射問題，傳統振動成像方法通常采取切片或組織透明化技術。然而，這些方法改變了球體的代謝狀態，無法用于活體樣品研究。深度穿透的多光子或光片熒光顯微鏡可以對活體球體進行成像，但熒光標記對脂質小分子有明顯干擾。SWIP克服了上述挑戰。研究者首先驗證了SWIP在單層細胞中的化學對比度。SWIP能很好地反映細胞內脂質分布，并能顯示細胞的形態。利用脂質和散射背景的不同熱衰減系數，圖中的水背景能被去除，從而增強了細胞內脂質的對比度。研究者展示了SWIP能成像一個直徑約200微米的完整腫瘤球。脂質在生物組織中起著重要作用，包括能量存儲、信號傳遞和脂溶性營養物質的運輸。成像組織內部的脂質含量及其分布使得各種應用成為可能。由于熒光標記對脂質分子有擾動，振動成像被廣泛用于脂質研究。然而，目前的振動成像技術無法在深層組織中實現高分辨率脂質成像。通常通過組織切片進行高分辨率的逐層成像，但切片過程通常會引入形態學偽影并導致脂質丟失。研究者展示SWIP在各種類型組織中的脂質成像。包括新鮮的豬肝切片，小鼠耳朵，小鼠大腦和健康人的乳腺活檢。即使在富含血液的新鮮肝臟中，SWIP也能夠分辨出小至1.0微米的脂肪滴。通過對小鼠大腦成像，SWIP成功探測到深達一毫米的微小脂類信號。這些深層組織的微小信號無法通過現有技術實現。研究者還展示了背向探測的SWIP成像結果，表明在體SWIP成像是可以實現的。SWIP與現有振動成像技術在穿透深度和空間分辨率上的比較如圖5所示。這些技術可以分為三組。第一組（左下方）具有亞細胞分辨率和靈敏度，但成像深度有限，最多為100微米。第二組（右上方）具有較深的穿透深度，但空間分辨率相對較差，最佳情況下為數百微米。盡管短波紅外光聲顯微鏡可以通過更好的光學聚焦實現更高的空間分辨率，但由于信號損失大，導致其檢測靈敏度低，進而限制了其對細胞內小成分的探測。顯然，振動成像在深穿透深度和亞細胞分辨率之間存在一個空白。該研究表明，SWIP成功填補了這一空白。SWIP提供的毫米深度、微米空間分辨率、高靈敏度振動成像能力為許多應用提供機會，包括活體類器官研究、無切片組織病理學、動態胚胎成像等。
相關論文信息：
https://www.nature.com/articles/s41566-024-01463-6延伸閱讀：
《新興圖像傳感器技術及市場-2024版》
《光譜成像市場和趨勢-2022版》
