【光電智造】一文讀懂顯微鏡的分辨率與衍射極限

之前我在文章中談論過圖片以及顯示器的分辨率，這種分辨率往往與像素有關，為：橫向像素數(shù)量*縱向像素數(shù)量。

然而，對于顯微鏡，‘分辨率’是指另一個概念：

視野中兩個能被區(qū)分的實體點之間的最小距離。

小白可能會問，既然是兩個分開的小點，只要放大倍數(shù)足夠大不就可以區(qū)分嗎？

實際上，對于光學顯微鏡，成像分辨率往往卡在200nm左右，這也是光學顯微鏡研究者常說的衍射極限。

為什么會有這個衍射極限？接下來我將一步步說明。我盡力通俗易懂，讓小白也能很快明白。

1. 圓孔夫瑯禾費衍射圖樣與艾里斑

我們不用管夫瑯禾費是誰，只需要知道，我們高中就學過光具有波粒二象性。既然光具有波的性質(zhì)，那就會有衍射。從圓孔出來的光不是平行光，而是像水波一樣會有干涉和衍射。

因而，對于點光源，經(jīng)過圓孔和透鏡聚焦成像之后會是這個樣子：

顯然，從結果上看，并不是一個無限小的點，而是由中心斑點和一個個圓環(huán)組成。

什么是艾里斑？

艾里斑：點光源通過理想透鏡成像時，由于夫瑯禾費圓孔衍射而在焦點處形成的光斑。中央是明亮的圓斑，周圍有一組較弱的明暗相間的同心環(huán)狀條紋，把其中以第一暗環(huán)為界限的中央亮斑稱作艾里斑。

2. 艾里斑如何影響分辨率？---瑞利判據(jù)

觀察上述圖像，顯然，當兩個艾里斑離得過近時，我們很難分清是一個、兩個、還是多個斑點在一起。

什么情況下可以區(qū)分？

瑞利判據(jù)：當一個圓斑像的中心剛好落在另一圓斑像的邊緣（即艾里斑邊緣）上時，被認為剛剛能被分辨。

所以，能區(qū)分開的兩個艾里斑，中心點距離會大于艾里斑的半徑。

艾里斑的半徑怎么計算？

下面我給出了公式。具體的數(shù)學推導省略。（雖然我也想裝逼，但是這里真不會）

到此，我們知道了在艾里斑的基礎上，相距多遠時才能夠區(qū)分。與圓孔直徑、入射光波長、透鏡焦距有關。

3. 光學顯微鏡的分辨率極限

還記得上面顯微鏡分辨率的定義嗎？?結合瑞利判據(jù)，對于顯微鏡而言，分辨率極限就是艾里斑的半徑。

顯微鏡的分辨率公式，可由艾里斑半徑公式推導而來（推導過程省略），如下：

可以看到，和上面艾里斑半徑公式的計算方式非常相似，只是引入了NA（數(shù)值孔徑，Numerical aperture）的概念。

NA=n*sinα n和α的定義在圖片已作出解釋。

在實際成像中，如普通熒光顯微鏡，λ大小往往是固定的，而sinα最大也只能取到1，n最大也只能是1.7左右。

假設波長λ約為550納米的綠光（GFP熒光），NA取1.7，代入公式，R的計算結果約為197nm。

改變參數(shù)后也仍在200nm左右, 這就是衍射極限數(shù)值的由來。

(其實還有一種計算顯微鏡的分辨率的方法是利用阿貝衍射公式：d= λ/2NA，雖然計算角度不同，但結果差別不大，在此不作細究)

當然上述分辨率極限說的只是普通的光學顯微鏡，電鏡顯微鏡分辨率計算原理相似，主要是靠波長λ小。

那光學顯微鏡就永遠卡在200nm分辨率了嗎？

當然不。事實上，經(jīng)過相關生物物理學家的進一步探索，已經(jīng)出現(xiàn)了多種打破衍射極限的光學顯微鏡，即超分辨光學顯微鏡，如SIM，PALM, STORM, STED, MINFLUX等。我之后再一步步解釋其原理。