近年來(lái)，合成生物學(xué)的快速發(fā)展為腫瘤細(xì)菌療法的深度優(yōu)化帶來(lái)新的契機(jī)。基于合成生物學(xué)手段，科學(xué)家們能夠利用基因工程改造的微生物或細(xì)胞而非傳統(tǒng)的化學(xué)小分子或生物制劑，作為新型疾病治療方法的開(kāi)發(fā)基礎(chǔ)。人工設(shè)計(jì)的攜帶有合成基因線(xiàn)路的微生物或細(xì)胞能夠響應(yīng)疾病標(biāo)志物或者外界信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放位置、釋放時(shí)間和釋放劑量的控制，已逐漸發(fā)展為人類(lèi)對(duì)抗疾病的強(qiáng)有力武器。
在傳統(tǒng)的細(xì)菌改造基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)理性設(shè)計(jì)的基因通路賦予了底盤(pán)細(xì)菌更多樣化的治療能力，彌補(bǔ)了天然菌株在腫瘤治療方面的缺陷，腫瘤細(xì)菌療法也因此成為極富應(yīng)用前景的新型腫瘤療法。現(xiàn)有腫瘤細(xì)菌療法的優(yōu)化策略主要集中在新型藥物的應(yīng)用、新型可控釋放方式的引入等，但是卻忽略了細(xì)菌自身行為對(duì)腫瘤治療效果的影響，缺乏對(duì)腫瘤治療過(guò)程中細(xì)菌行為的持續(xù)控制。腫瘤治療是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，可控持續(xù)的藥物釋放是提高腫瘤治療效果的關(guān)鍵，雖然在材料領(lǐng)域通過(guò)高分子水凝膠和脂質(zhì)等已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了藥物的持續(xù)釋放，但是在腫瘤細(xì)菌療法中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
近日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所金帆課題組在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊National Science Review上發(fā)表了題為“Programming the lifestyles of engineered bacteria for cancer therapy”的研究成果。通過(guò)合成生物學(xué)的設(shè)計(jì)，研究人員成功地將銅綠假單胞菌菌株改造成為具有實(shí)體瘤治療功效的工程菌。在治療過(guò)程中，該工程菌的全局表型可被近紅外光的輻照程序精確的控制，即：在弱定殖、定殖以及裂解釋藥三種表型切換，從而更有效的消融瘤體達(dá)到治療效果，具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
審稿人認(rèn)為該工作具有極高的創(chuàng)新性且總體設(shè)計(jì)思路非常精妙，將對(duì)腫瘤細(xì)菌療法領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的影響。（“The overall system design is highly elegant”，“I believe the work will have a major impact in the field”）。深圳先進(jìn)院合成所助理研究員張榮榮為論文共同第一作者及共同通訊作者，金帆研究員為文章通訊作者。
文章上線(xiàn)截圖
在自然界中，銅綠假單胞菌在有利的環(huán)境中處于浮游狀態(tài)，其在表面定殖的能力較弱；而在不利的環(huán)境中則會(huì)進(jìn)入生物被膜狀態(tài)，其表面定殖能力大大增強(qiáng)。受到自然界中細(xì)菌生存方式的啟發(fā)，研究團(tuán)隊(duì)為工程菌設(shè)計(jì)了浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)對(duì)其定殖能力的控制，其中浮游狀態(tài)細(xì)菌的定殖能力較弱，能夠減少對(duì)正常組織的傷害；而生物被膜狀態(tài)細(xì)菌的定殖能力較強(qiáng)，能夠增加其在腫瘤組織內(nèi)的定殖量。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)敲除毒力因子調(diào)控蛋白編碼基因vfr和三型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因exoS和exoT構(gòu)建了減毒的銅綠假單胞菌菌株作為腫瘤細(xì)菌療法中的新型底盤(pán)菌株。銅綠假單胞菌在浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)兩種生活方式之間的切換與第二信使分子環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（c-di-GMP）的濃度密切相關(guān)，為此，研究團(tuán)隊(duì)使用兩個(gè)基因模塊對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)的c-di-GMP濃度進(jìn)行控制，分別是1）通過(guò)組成型啟動(dòng)子表達(dá)磷酸二酯酶PA2133以分解c-di-GMP，使細(xì)菌維持較低的胞內(nèi)c-di-GMP水平，進(jìn)入浮游狀態(tài)；2）引入可在近紅外光照射下合成c-di-GMP的光敏蛋白BphS，近紅外光照射可使細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平升高，細(xì)菌進(jìn)入生物被膜狀態(tài)。此外，為了實(shí)現(xiàn)治療藥物的控制釋放，研究團(tuán)隊(duì)為工程菌設(shè)計(jì)了第三種生活方式，即裂解狀態(tài)，通過(guò)c-di-GMP響應(yīng)型啟動(dòng)子表達(dá)裂解基因，可使細(xì)菌在c-di-GMP升高后進(jìn)入裂解狀態(tài)（圖1）。這樣，細(xì)菌的三種生活方式便均與c-di-GMP的濃度相關(guān)。通過(guò)改變近紅外光的照射強(qiáng)度，可以控制活化的BphS蛋白的數(shù)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)工程菌胞內(nèi)的c-di-GMP的濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌生活方式的控制。除了光照強(qiáng)度的影響，理論模擬的結(jié)果表明：PA2133上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS1）與抗終止蛋白Q上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS2）的強(qiáng)度將對(duì)使細(xì)菌進(jìn)入不同的生活方式所需的近紅外光光強(qiáng)產(chǎn)生巨大的影響。
圖1 用于編程細(xì)菌生活方式的基因線(xiàn)路的設(shè)計(jì)
為了獲得能夠在不同強(qiáng)度的近紅外光照射下呈現(xiàn)三種生活方式的工程菌，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)RBS1和RBS2進(jìn)行批量替換，并通過(guò)96孔光照裝置對(duì)候選菌株進(jìn)行批量篩選，隨后利用顯微鏡進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到的工程化菌株被命名為H017（圖2）。通過(guò)層級(jí)性調(diào)控近紅外光的照射強(qiáng)度可以編程H017的生活方式，當(dāng)對(duì)H017施加中等強(qiáng)度-高強(qiáng)度循環(huán)的近紅外光光照程序時(shí)，細(xì)菌將進(jìn)入生物被膜狀態(tài)-裂解狀態(tài)生活方式循環(huán)。
圖2 通過(guò)層級(jí)性調(diào)節(jié)近紅外光的強(qiáng)度編程細(xì)菌生活方式
為了在體外驗(yàn)證工程菌的三種生活方式在腫瘤治療中的作用，研究團(tuán)隊(duì)在微流通道中進(jìn)行了細(xì)菌-細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（圖3）。研究團(tuán)隊(duì)首先證實(shí)，當(dāng)對(duì)指定區(qū)域的細(xì)胞施加不同強(qiáng)度的近紅外光光照時(shí)，工程菌能夠精確地在該區(qū)域內(nèi)進(jìn)入對(duì)應(yīng)的生活方式。當(dāng)對(duì)指定區(qū)域的細(xì)胞施加中等強(qiáng)度-高強(qiáng)度的光照程序時(shí)，H017先進(jìn)入生物被膜狀態(tài)并大量定殖在細(xì)胞表面，隨后進(jìn)入裂解狀態(tài)釋放治療藥物造成細(xì)胞壞死。以上結(jié)果表明，能夠通過(guò)近紅外光對(duì)工程菌的生活方式進(jìn)行高時(shí)空分辨率的控制。此外，綜合對(duì)照組實(shí)現(xiàn)的結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)的藥物累積過(guò)程與裂解狀態(tài)的藥物釋放過(guò)程是H017殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵。
圖3 編程細(xì)菌“生物被膜-裂解”生活方式轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放
隨后，研究團(tuán)隊(duì)使用小鼠皮下瘤模型探究能否通過(guò)近紅外光控制工程菌在瘤內(nèi)的生活方式并實(shí)現(xiàn)預(yù)期的功能（圖4）。結(jié)果顯示，在瘤內(nèi)注菌后，避光培養(yǎng)三天組的小鼠（D3）腫瘤組織內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量與注射PBS組沒(méi)有顯著差異，表明進(jìn)入浮游狀態(tài)生活方式的細(xì)菌難以在腫瘤內(nèi)定殖；中等光強(qiáng)照射三天組的小鼠（M3）腫瘤組織內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量與D3組相比顯著增加，表明進(jìn)入生物被膜狀態(tài)生活方式的細(xì)菌在腫瘤組織內(nèi)的定殖能力大大增強(qiáng)；中等光強(qiáng)照射兩天高光強(qiáng)照射一天組的小鼠（M2-H1）與M3組相比，細(xì)菌數(shù)量顯著降低，且M2-H1組的腫瘤組織切片中能夠看出明顯的壞死區(qū)域，表明細(xì)菌裂解后釋放藥物并殺傷了腫瘤細(xì)胞；中等光強(qiáng)照射兩天高光強(qiáng)照射一天再中等光強(qiáng)照射兩天組的小鼠（M2-H1-M2）與M2-H1組相比，細(xì)菌數(shù)量再次上升，這表明細(xì)菌在中等光強(qiáng)照射后，再次進(jìn)入定殖生長(zhǎng)狀態(tài)。此外，在中等光強(qiáng)近紅外光照射七天后，瘤內(nèi)的工程菌仍然具有裂解能力，表明該基因線(xiàn)路具有較好的穩(wěn)定性。綜合以上結(jié)果可知，不同強(qiáng)度的近紅外光照射能夠使瘤內(nèi)細(xì)菌進(jìn)入對(duì)應(yīng)的生活方式并實(shí)現(xiàn)預(yù)期的功能，而通過(guò)連續(xù)改變的光照程序能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)瘤內(nèi)細(xì)菌生活方式的持續(xù)控制。
圖4 通過(guò)近紅外光操控實(shí)體瘤內(nèi)的細(xì)菌生活方式
最后，研究團(tuán)隊(duì)探究能否通過(guò)編程工程菌生活方式增強(qiáng)其腫瘤治療效果（圖5）。當(dāng)H017僅作為藥物遞送載體時(shí)，高強(qiáng)度的近紅外光光照能夠使H017裂解釋放藥物，完成腫瘤治療。團(tuán)隊(duì)在20天的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，通過(guò)8次注菌，有效抑制了腫瘤生長(zhǎng)。接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)光照程序?qū)?xì)菌的生活方式進(jìn)行控制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物累積和藥物釋放的持續(xù)控制。結(jié)果顯示，在對(duì)小鼠施加兩個(gè)循環(huán)周期的中等強(qiáng)度2天-高強(qiáng)度1天的近紅外光光照程序（M2-H1×2）后，小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到了抑制，而對(duì)照組無(wú)法抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)。在更長(zhǎng)周期的實(shí)驗(yàn)中（M2-H1×6），通過(guò)光照時(shí)間編程細(xì)菌生活方式進(jìn)行腫瘤治療使所有小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到了抑制，其中30%小鼠的腫瘤完全消失，而對(duì)照組小鼠的腫瘤則持續(xù)生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，編程細(xì)菌生活方式在腫瘤的長(zhǎng)期治療過(guò)程中具有顯著優(yōu)勢(shì)，能夠在較少的注菌次數(shù)下獲得更好的腫瘤抑制效果。
圖5 編程瘤內(nèi)細(xì)菌生活方式促進(jìn)實(shí)體瘤消退
該研究得到國(guó)家科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基因，中國(guó)科學(xué)院科研儀器設(shè)備研制項(xiàng)目、中國(guó)博士后科學(xué)基金，長(zhǎng)安私人資本、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等多個(gè)項(xiàng)目的支持，并得到了合成生物重大科技基礎(chǔ)設(shè)施團(tuán)隊(duì)的大力協(xié)助。
