使用基于微針（MN）的檢測法連續(xù)監(jiān)測組織液（ISF）中臨床相關(guān)的生物標(biāo)志物，有可能改變醫(yī)療保健。來自麥克馬斯特大學(xué)（McMaster University）的研究人員提出了一種名為“Wearable Aptalyzer”的集成系統(tǒng)，通過將用于ISF提取的生物相容性水凝膠MN（HMN）陣列與用于原位監(jiān)測血液分析物的基于電化學(xué)適配體的生物傳感器相結(jié)合而制造，可以用于ISF中葡萄糖和乳酸的實(shí)時(shí)和多路復(fù)用監(jiān)測。使用1型糖尿病小鼠和大鼠模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，從基于ISF的Wearable Aptalyzer收集的測量值與從血糖和乳酸金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得的測量值之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性。Wearable Aptalyzer有效解決了酶檢測方法以及實(shí)心MN生物傳感器固有的局限性，以及對可靠和多路生物分析體內(nèi)監(jiān)測的需求。相關(guān)研究成果以“Wearable Aptalyzer Integrates Microneedle and Electrochemical Sensing for In Vivo Monitoring of Glucose and Lactate in Live Animals”為題發(fā)表在Advanced?Materials期刊上。圖1 用于體內(nèi)分析的可Wearable Aptalyzer的制造集成的Wearable Aptalyzer將用于ISF提取的HMN貼片與用氧化還原適配體功能化的電極相結(jié)合，用于靶標(biāo)分析。簡而言之，透明質(zhì)酸（HA）用甲基丙烯酸酸酐（MA）進(jìn)行了過夜的化學(xué)修飾。然后對通過沉淀和透析純化所得的MeHA進(jìn)行凍干。隨后，將HC-MeHA溶液澆鑄到圖案化模具中，以制造HMN貼片。經(jīng)過過夜干燥過程后，將貼片脫模并在紫外線（UV）照射下交聯(lián)40分鐘。接下來，將100 μL LC-MeHA施加到功能化電極上，以形成覆蓋工作電極、對電極和參比電極的薄粘合層。其中，LC-MeHA起到膠水的作用，將HMN貼片附著在固體電極上。隨后，修剪交聯(lián)的HMN貼片，將其置于LC-MeHA上，并風(fēng)干30 min。最后，將集成器件在紫外線下進(jìn)一步交聯(lián)10分鐘。利用LC-MeHA可以將電極牢固地連接到HMN貼片上，從而在隨后的動物實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)了集成器件的穩(wěn)健性。該研究將集成的貼片/電極器件轉(zhuǎn)換為可穿戴適配體。具體而言，研究人員將一種表征良好的適配體（乳酸或葡萄糖）通過金硫醇化學(xué)錨定在金工作電極上，并使用電化學(xué)阻抗譜（EIS）和循環(huán)伏安法（CV）驗(yàn)證其附著力。此外，用亞甲藍(lán)標(biāo)記適配體作為電化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氧化還原報(bào)告基因。在靶標(biāo)結(jié)合時(shí)，氧化還原適配體發(fā)生構(gòu)象變化，使亞甲藍(lán)靠近金表面，與沒有靶標(biāo)的情況相比，電子轉(zhuǎn)移率增加。SWV用于測量Wearable Aptalyzer產(chǎn)生的信號。利用氧化還原適配體結(jié)合態(tài)和未結(jié)合態(tài)之間的電荷轉(zhuǎn)移動力學(xué)差異來計(jì)算動力學(xué)差分測量（KDM）。該方法可有效減少傳感器間的變異性，校正信號漂移，并提高信噪比。信號開啟和信號關(guān)閉頻率是使用Lovric形式確定的。葡萄糖和乳酸傳感器分別在較高頻率（葡萄糖為80 Hz，乳酸適配體為200 Hz）和較低頻率（葡萄糖為5 Hz，乳酸適配體為15 Hz）下表現(xiàn)出信號開啟和信號關(guān)閉響應(yīng)。在制造HMN貼片之后，首先評估了它們的物理特性。為確保有效的皮膚滲透，HMN貼片必須具有鋒利且完整的針頭，這一點(diǎn)至關(guān)重要。使用掃描電子顯微鏡（SEM）評估HMN貼片的形態(tài)，顯示完整而鋒利的針尖。接下來，通過計(jì)算使用SEM成像的相應(yīng)膨脹水凝膠的平均孔徑來研究HC-MeHA和LC-MeHA水凝膠的孔隙率。HC-MeHA和LC-MeHA的孔隙率分別為37%和65%。HC-MeHA在HMN內(nèi)形成致密的聚合物網(wǎng)絡(luò)，從而在吸水后保持其結(jié)構(gòu)。相比之下，LC-MeHA在HMN貼片和電極之間起到粘附層的作用，形成密度較低的聚合物網(wǎng)絡(luò)。交聯(lián)的程度主要取決于聚合物含量、紫外線固化的持續(xù)時(shí)間和交聯(lián)劑的濃度。為了研究HMN貼片收集足夠ISF所需的持續(xù)時(shí)間，使用豬皮評估了HMN的腫脹能力。使用HC-MeHA制備HMN貼片，在其背面增加一層LC-MeHA（HC+LC-MeHA HMN），并在一塊豬皮膚上應(yīng)用不同持續(xù)時(shí)間，并測量其相應(yīng)的腫脹率。我們觀察到HC+LC-MeHA HMN貼片在豬皮膚應(yīng)用后6 min內(nèi)達(dá)到119.45%的最大腫脹，表明HMN有助于在真實(shí)皮膚環(huán)境下快速有效地收集ISF樣本。圖2?HMN貼片和集成的Wearable Aptalyzer的物理表征通過壓縮測試評估了HMN貼片的機(jī)械強(qiáng)度，評估了它們穿透皮膚的能力。通過對HC+LC-MeHA HMN貼片進(jìn)行檢測，探討添加LC-MeHA對HMN貼片力學(xué)性能的影響。測量并繪制了施加壓縮力后針尖的位移。該數(shù)據(jù)表明，HC-MeHA HMN和HC+LC-MeHA HMN每根針頭都可以承受超過0.3 ~ 0.4 N的力，這對于穿透人體皮膚是必要的，而不會發(fā)生明顯的針頭斷裂。重要的是，包含LC-MeHA層不會影響HMN貼片的機(jī)械強(qiáng)度。
在表征了HMN貼片的物理性質(zhì)后，將HMN貼片與使用LC-MeHA作為粘附層的氧化還原適配體功能化的電極集成在一起。為了評估HMN貼片與電極的附著，進(jìn)行了拉動實(shí)驗(yàn)。如圖2f所示，模擬HMN貼片的HC-MeHA薄膜通過一層LC-MeHA附著在功能化電極上。然后連接一條非彈性膠帶并施加側(cè)向力，將薄膜從電極上拉開，并在實(shí)際應(yīng)用中的身體運(yùn)動過程中刺激施加在HMN貼片上的力。Wearable Aptalyzer傳感與優(yōu)化在驗(yàn)證Wearable Aptalyzer的實(shí)際應(yīng)用性能之前，使用CV和EIS在開路電位下對器件制造進(jìn)行電化學(xué)表征。用葡萄糖和乳酸適配體探針進(jìn)行生物功能化后，電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻分別增加了12366%和3073%。此外，在添加巰基己醇（MCH）作為葡萄糖和乳酸傳感器的表面阻斷劑后，抵抗力進(jìn)一步增加了22%和70%。最后，在連接HMN后，電荷轉(zhuǎn)移電阻如預(yù)期般增加了23%和25%。在Wearable Aptalyzer的每個(gè)制造步驟之后，還記錄了CV測量值。與前一步相比，每一步制造后都觀察到電化學(xué)電流減少。這是由于在制造過程中添加的每一層都施加了空間位阻，從而減少了電解質(zhì)對電極表面的接觸。觀察到的電化學(xué)電流趨勢與EIS計(jì)算的電荷轉(zhuǎn)移電阻結(jié)果一致，并證實(shí)了每個(gè)功能層都成功地添加到器件中，進(jìn)一步驗(yàn)證了Wearable Aptalyzer的成功制造。接下來，使用加標(biāo)不同濃度的目標(biāo)分析物的人工ISF（aISF）對葡萄糖和乳酸Aptalyzer傳感器進(jìn)行體外評估。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以迭代方式進(jìn)行，從空白aISF樣品開始，然后增加濃度（向上校準(zhǔn)），或者從aISF中目標(biāo)分析物的最高濃度開始，然后稀釋（向下校準(zhǔn)）。葡萄糖Aptalyzer暴露于濃度范圍為0 ~ 50 mM，涵蓋正常生理范圍，以及超過低血糖和高血糖水平。選擇0 ~ 20mM的乳酸范圍以包括生理范圍以及高乳酸血癥。孵育20分鐘后，測量電化學(xué)信號。在向上校準(zhǔn)期間，Aptalyzer傳感器會產(chǎn)生一個(gè)電化學(xué)信號，該信號隨著目標(biāo)分析物濃度的增加而單調(diào)增加，與適配體傳感器的操作機(jī)制保持一致：由于亞甲藍(lán)與電極的相互作用更頻繁，目標(biāo)濃度的增加導(dǎo)致更大的電化學(xué)電流。然后計(jì)算所得的KDM，以獲得葡萄糖和乳酸 Aptalyzer傳感器的校準(zhǔn)曲線。與葡萄糖校準(zhǔn)曲線的對數(shù)線性擬合產(chǎn)生2.4 mM的檢測限，用于檢測覆蓋低血糖范圍的葡萄糖。此外，通過將對數(shù)線性線擬合到乳酸校準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)1.04 mM的檢測限。在向下校準(zhǔn)過程中觀察到不同的行為，導(dǎo)致葡萄糖和乳酸的檢測限分別為7.44和4.43 mM。圖3?Wearable Aptalyzer的離體驗(yàn)證為了進(jìn)一步研究所開發(fā)平臺的完整性，葡萄糖Aptalyzer傳感器通過引入一組在ISF中發(fā)現(xiàn)的常見干擾劑來挑戰(zhàn)，包括乳酸、抗壞血酸、甘氨酸、L-丙氨酸、氯化鎂、羥基丁酸酯、蔗糖、尿酸、牛血清白蛋白（BSA）和半乳糖，所有這些都在aISF中加標(biāo)。除氯化鎂外，aISF中所有化合物的濃度均為10 mM，氯化鎂為5 mM（葡萄糖的濃度在生理范圍內(nèi)，但其他干擾物的濃度明顯高于正常水平）。在所有測試的干擾物（包括糖和氨基酸）中，沒有一種表現(xiàn)出對檢測葡萄糖的干擾，顯示出葡萄糖Aptalyzer傳感器的優(yōu)異特異性。同樣，通過引入在ISF中發(fā)現(xiàn)的相同濃度的干擾化合物來檢查乳酸Aptalyzer的選擇性。計(jì)算出的信號增益清楚地表明，盡管非目標(biāo)分子的濃度非常高，但乳酸Aptalyzer傳感器對乳酸表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性。使用小鼠模型對Wearable Aptalyzer進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證在驗(yàn)證了Wearable Aptalyzer離體的性能后，研究人員使用動物模型評估了集成器件的性能。在體內(nèi)評估之前，建立了基于單頻電化學(xué)阻抗測量的質(zhì)量控制程序，以識別有故障的傳感器。根據(jù)此程序，傳感器演示|ΔZ/Z| > 500個(gè)在插入皮膚后被認(rèn)為是有缺陷的，被排除在外。ΔZ/Z表示與功能化傳感器相比，將HMN連接到Wearable Aptalyzer后觀察到的電化學(xué)阻抗變化。此外，葡萄糖裝置在80 Hz時(shí)的電流為-30 nA，乳酸裝置在200 Hz時(shí)的電流為-100 nA，被確定為體內(nèi)測試的截止點(diǎn)。還確定了噪聲值為0.01的均方根（RMS）和信號開啟條件下的信噪比為3作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的臨界值。傳感器故障可能是由于HMN貼片與電極的連接不完整或HMN貼片與皮膚的插入不完美造成的。采用Wearable Aptalyzer傳感器，通過將集成器件應(yīng)用于健康的野生型小鼠的背部皮膚，對健康的野生型小鼠進(jìn)行連續(xù)的葡萄糖和L-乳酸測量。首先通過應(yīng)用Wearable Aptalyzer 5分鐘并在移除器件后收集皮膚樣本來評估HMN貼片的滲透。同時(shí)，從尾部收集的小鼠血液樣本用于使用手持式血糖儀測量血糖，如所述。通過Wearable Aptalyzer測量的血糖水平和葡萄糖KDM值在測試動物上遵循類似的變化趨勢。這證實(shí)了Wearable Aptalyzer在檢測波動的葡萄糖濃度方面的可靠性。用于多路復(fù)用測量的Wearable Aptalyzer的體內(nèi)驗(yàn)證為了評估我們的檢測在各種動物模型中的潛在適用性，使用糖尿病大鼠模型進(jìn)一步表征和測試了Wearable Aptalyzer。首先，研究了該裝置對大鼠皮膚滲透的有效性以及應(yīng)用HMN后皮膚的恢復(fù)效果。圖5a顯示了Wearable Aptalyzer在皮膚穿透前后，突出了皮膚穿透時(shí)腫脹和完整針頭的存在。此外，HMN和電極之間的連接保持牢固就位。隨后，研究人員監(jiān)測了HMN穿透后針頭在大鼠皮膚上的痕跡（圖5b）。在取下HMN貼片后，立即觀察到針頭的明顯印記，提供了有效皮膚滲透的明確證據(jù)。然而，針印在20分鐘后消失，表明皮膚恢復(fù)。皮膚的H&E染色還顯示大鼠皮膚內(nèi)有一個(gè)深度為92.5 μm的針腔（圖5c）。這些結(jié)果表明，Wearable Aptalyzer能夠有效地穿透大鼠皮膚，并且在移除后，皮膚表現(xiàn)出快速恢復(fù)。圖5?使用Wearable Aptalyzer進(jìn)行體內(nèi)表征和多路復(fù)用監(jiān)測通過使用Wearable Aptalyzer器件，對糖尿病大鼠的葡萄糖和乳酸進(jìn)行了同步、多路復(fù)用測量。具體來說，連續(xù)監(jiān)測乳酸和葡萄糖可以準(zhǔn)確評估運(yùn)動的代謝副產(chǎn)物，該副產(chǎn)物與糖尿病患者的運(yùn)動強(qiáng)度相關(guān)，并有助于準(zhǔn)確預(yù)測血糖反應(yīng)和必要的胰島素劑量。糖尿病大鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食4小時(shí)，然后給予人重組胰島素以降低其血糖水平。將兩個(gè)乳酸和兩個(gè)葡萄糖Wearable Aptalyzer傳感器應(yīng)用于大鼠的剃光背部，并連續(xù)監(jiān)測動物的葡萄糖和乳酸水平。數(shù)據(jù)是在五個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)收集的。同時(shí)，從葡萄糖和乳酸器件獲得的數(shù)據(jù)分別使用手持式血糖儀和比色L-乳酸試劑盒進(jìn)行交叉驗(yàn)證。葡萄糖Wearable Aptalyzer顯示胰島素注射后KDM降低，而乳酸KDM隨著時(shí)間的推移保持一致，證實(shí)了與基于血液的測量相似的變化趨勢。綜上所述，研究人員報(bào)告了一種基于適配體的電化學(xué)傳感器，可以與HMN集成，用于ISF中生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)和體內(nèi)分析。該器件被稱為Wearable Aptalyzer，將使用超靈敏電化學(xué)讀數(shù)的原位生物標(biāo)志物測量與強(qiáng)大的HMN機(jī)械強(qiáng)度相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)有效的皮膚滲透和ISF采樣。Wearable Aptalyzer在檢測真實(shí)皮膚環(huán)境中的臨床相關(guān)葡萄糖和乳酸濃度方面表現(xiàn)出高靈敏度和特異性。使用小鼠和大鼠模型研究了Wearable Aptalyzer的性能。重要的是，Wearable Aptalyzer顯示出穩(wěn)定的電化學(xué)信號，能夠連續(xù)監(jiān)測乳酸，在清醒的糖尿病大鼠中，乳酸與血乳酸相關(guān)至少3天。從健康小鼠和糖尿病大鼠獲得的體內(nèi)結(jié)果表明，Wearable Aptalyzer在監(jiān)測兩種不同動物模型的葡萄糖和乳酸變化趨勢波動方面具有功效。特別是，利用Wearable Aptalyzer同時(shí)監(jiān)測葡萄糖和乳酸，凸顯了其為糖尿病管理定制個(gè)性化治療方法的潛力。值得注意的是，Wearable Aptalyzer作為一個(gè)通用的傳感平臺，能夠使用不同的適配體追蹤各種臨床上重要的生物標(biāo)志物，而這些都是酶促無法實(shí)現(xiàn)的。這證明了將Wearable Aptalyzer應(yīng)用于廣泛的連續(xù)監(jiān)測技術(shù)的潛力。論文鏈接：
https://doi.org/10.1002/adma.202313743
延伸閱讀：
《即時(shí)診斷應(yīng)用的生物傳感器技術(shù)及市場-2022版》
《基于拉曼光譜的血糖監(jiān)測專利態(tài)勢分析-2024版》
《雅培輔理善瞬感?持續(xù)血糖監(jiān)測傳感器產(chǎn)品分析》
《糖尿病管理技術(shù)及市場-2022版》
《可穿戴技術(shù)及市場-2023版》
《給藥應(yīng)用的微針專利態(tài)勢分析-2020版》
