小細胞外囊泡（sEV），例如外泌體，通過血液循環在局部及非局部范圍發揮細胞間通訊的關鍵作用。這些囊泡不僅存在于血液中，也存在于幾乎所有其它生物體液中。源自內體途徑的小細胞外囊泡直徑在30至150納米之間，平均直徑約為100納米。小細胞外囊泡表面蛋白和其內部所含的物質與其細胞來源相關，使其成為研究生物過程的重要對象。精確識別和表征小細胞外囊泡對于探索其在正常生理過程和疾病相關機制中的作用至關重要。傳統的小細胞外囊泡表征方法，例如蛋白質印跡、酶聯免疫吸附測定和基于微珠的流式細胞術，在評估單個小細胞外囊泡的異質性方面存在顯著局限性。此外，這些方法每次檢測需要相對較大的生物液體樣本量，并不適合小樣本輸入。更重要的是，這些技術通常需要預先分離和純化，這些步驟耗時、回收率低且缺乏可重復性，因此將其轉化為臨床應用仍然存在挑戰。
微流控技術通過克服傳統流體處理相關的挑戰，為分析小細胞外囊泡提供了緊湊、高效及集成化的解決方案。微流控平臺能夠精確操控小體積樣品，并實現自動化樣品處理，具有高度可重復性。近年來，微流控系統的創新與光學檢測技術的結合，進一步推動了外泌體分析的發展。盡管基于熒光的技術在小細胞外囊泡分析中應用廣泛，但這些方法通常需要多種標記和洗滌步驟，涉及熒光染料、量子點或金納米顆粒，從而增加了檢測的復雜性和成本。因此，業界對無標記檢測方法的需求日益增長，以降低操作復雜性，保留原始生物結構，避免染料或標記的潛在干擾，并實現不受光漂白影響的實時定量分析。
等離子體傳感已成為一種有前景的無標記替代方案，它能夠在天然狀態下實時分析小細胞外囊泡。據麥姆斯咨詢介紹，美國休斯頓大學的一支研究團隊不久前開發了一種名為“PlAsmonic NanO-apeRture lAbel-free iMAging（PANORAMA）”的成像技術，專為無標記檢測納米顆粒而設計。該技術利用透明基底上排布的陣列化金納米盤（AGNIS）上的局域表面等離子體共振（LSPR）來檢測小至25 nm的納米顆粒。AGNIS是在玻璃基底上制造的高密度金納米盤，具有下凹結構，增強局部電場，并由于輻射耦合產生藍移的LSPR。AGNIS平臺能夠利用可見光在復雜生物環境中進行單囊泡檢測。
在這項最新的研究中，研究團隊將PANORAMA與定制設計的微流控平臺相結合，以增強檢測自動化、減少樣品體積需求，并提高了檢測重現性。該裝置在微流控通道內采用推拉式流動策略，以優化小細胞外囊泡捕獲效率，并提高檢測靈敏度。其微流控系統能夠精確控制流速、方向、介質體積及組成，從而支持優化的檢測條件。微流控-PANORAMA集成平臺通過氣動方式自動完成整個小細胞外囊泡捕獲和檢測過程，實現高通量處理，提高了檢測準確性。研究人員通過直接在微流控系統內檢測和定量血漿來源外泌體，展示了該平臺的強大能力。
（a）微流控通道設計。（b）AGNIS集成微流控器件的光學圖像。（c）微流控通道內單個AGNIS的SEM圖像。（d）緊密堆積AGNIS的SEM圖像。
示意圖展示了用于與微流控通道集成的矩形AGNIS的制造步驟
微流控納米等離子體成像平臺概覽。（a）微流控器件的概念圖。（b）AGNIS表面的SEM圖像。（c）用于從人血漿中捕獲外泌體的AGNIS表面功能化示意圖。（d）微流控器件集成PANORAMA光學裝置示意圖。
利用微流控-PANORAMA集成平臺檢測純化的外泌體
PANORAMA成像用于小細胞外囊泡檢測
總結而言，本研究展示了利用集成的自動化微流控系統，通過PANORAMA技術對純化外泌體及小細胞外囊泡進行無純化和無標記檢測、計數、尺寸表征。在微流控器件中采用推拉流動孵育策略，增強了抗體與血漿樣本之間的相互作用，從而實現了外泌體/小細胞外囊泡的高效捕獲。僅需20 μL的樣本，即可在人類血漿中捕獲、檢測和計數純化外泌體/小細胞外囊泡，并具有統計重現性。該平臺能夠直接從未經處理的血漿中檢測小細胞外囊泡，結合其樣本需求量小、高靈敏度和無標記操作的特點，表明其在基礎外泌體/小細胞外囊泡研究和臨床應用中的潛力。
通過多個獨立制備和功能化的器件獲得的一致結果，驗證了該平臺的重現性和特異性。然而，該研究的一個關鍵限制是所有基于血漿的實驗都使用了來自同一患者的樣本，未評估個體間的生物學差異。盡管這項研究的主要目標是驗證平臺在受控條件下的可行性和魯棒性，但未來的工作將涉及更大、更多樣化的臨床樣本集，這對于完全確立其普適性和轉化潛力至關重要。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s44328-025-00047-w
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