一種利用DNA鏈置換反應和酶促擴增來識別病毒RNA并在折紙上實施的分析方案，可以快速比色檢測具有單核苷酸特異性的新冠病毒（SARS-CoV-2）變異毒株。
據麥姆斯咨詢報道，近日，清華大學李景虹教授、四川大學華西醫院李為民院長和鄧銳杰研究員及團隊其他成員在Nature Biomedical Engineering上發表了一篇題為“A
paper-based assay for the colorimetric detection of SARS-CoV-2 variants
at single-nucleotide
resolution”的論文，闡述了一種用于新冠病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測的紙基檢測方法，該檢測方法速度快（從樣品輸入到出結果只需30分鐘）、便宜（單次檢測花費不到1美元），結果肉眼可讀。并且，該檢測方法可以檢測到每微升低至400拷貝的病毒RNA，并利用高度特異性的核酸相互作用來識別令人擔憂的SARS-CoV-2變異毒株。
利用MARVE技術對SARS-CoV-2變異毒株的檢測
為了建立這種靈敏、快速且簡單的檢測方法，李景虹教授及其團隊成員采用了一種無需核酸擴增的方案。他們將這種檢測技術命名為“MARVE（多路復用、無核酸擴增、單核苷酸分解的病毒進化）”，該檢測技術用到酚紅（一種常見的pH指示劑），隨著pH值的降低酚紅顏色會發生巨大變化（從紅色變為黃色）。為了將pH值的變化與病毒RNA聯系起來，研究人員巧妙地利用了Ag（銀）離子，使其與基于DNA的探針和酶脲酶相互作用。
與許多金屬陽離子一樣，Ag(I)（一價銀離子）與帶負電荷的DNA強烈的相互作用，當暴露于DNA雙螺旋中的胞嘧啶-胞嘧啶（C-C）錯配時形成C-Ag-C復合物。同時，水解尿素釋放弱堿氨的脲酶受到游離Ag(I)離子的強烈抑制。因此，為了檢測病毒RNA，研究人員設計了DNA探針，使其與SARS-CoV-2序列結合時釋放Ag(I)（下圖a）。釋放的Ag(I)轉而抑制脲酶活性，形成致使pH值較低的環境條件，出現黃色讀數。在沒有病毒RNA存在時，探針保留Ag(I)，活性脲酶分解尿素產生氨，形成致使pH值較高的環境條件，出現紅色讀數。該反應可在溶液中或紙質基材上進行，通過智能手機分析，可提供肉眼容易識別的比色測試結果。
a、立足點交換DNA探針（TEprobe）選擇性地與病毒RNA靶標相互作用，釋放Ag(I)離子以抑制脲酶水解，創建產生黃色讀數的低pH環境條件；b、將測定反應整合到折紙中
李景虹教授及其團隊在實驗中使用的立足點交換DNA探針是其特異性的核心。該探針由兩條部分互補的鏈（Rec和Block）組成，它們最初相互雜交。探針復合物中的Rec鏈有一個單鏈區域（稱為正向立足點），使其能夠與病毒RNA結合。探針另一端有一個雙鏈區域（反向立足點），其特征是與Ag(I) 結合的 C:C錯配（上圖a）。當目標病毒RNA與探針結合時，Block鏈被置換，導致反向立足點雙鏈體的破壞，釋放出Ag(I)。重要的是，正向和反向立足點的序列經過精心編程，因此只有與Rec鏈的識別區域完全互補的病毒RNA才能完成Block鏈的置換。
具有單點突變的RNA會產生錯配，從而阻止置換反應的進行。研究人員通過對探針的設計來識別不同的目標RNA，并證明MARVE可以檢測3種冠狀病毒（SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2）和7種流感亞型。此外，他們設計了一種折紙方案，用于該類檢測的便攜式部署。該折紙方案的反應步驟跨越多個紙層，通過簡單地折疊紙以使反應中間體從一層流到下一層來順序進行（上圖b）。該折紙方案通過多個樣本加載站點，可同時檢測多種病毒，以及基于智能手機的圖像處理。
單核苷酸突變檢測
此外，李景虹教授及其團隊采用MARVE技術來檢測SARS-CoV-2變異毒株。他們實施了探針設計管道，并建立了用于檢測 SARS-CoV-2的陣列反應，并在一張折紙中區分了SARS-CoV-2的4種不同變異毒株。這種僅用18天開發的多路復用MARVE檢測方法，可在30分鐘內提供肉眼或智能手機可見的檢測結果。值得注意的是，它可以處理快速熱裂解直接產生的RNA樣本，無需靶標擴增或富集，從而減少了檢測步驟和獲得結果的時間。經臨床咽拭子樣本驗證，該方法與通過RT-qPCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）和測序獲得的結果完全一致。
總體而言，MARVE技術將核酸檢測的特異性及檢測時間和成本相結合，接近橫向流動檢測。這些特點的核心是Ag(I)/脲酶介導的檢測方案。該方案只需要一個單一的酶和一個單一的DNA探針，避免了核酸擴增步驟，否則會增加檢測的時間、成本和復雜性。MARV反應在室溫下進行，無需加熱塊（熱裂解步驟除外）。此外，MARVE檢測的開發速度很快，因為只需要為每個有意義的目標RNA序列設計一個探針。相反，對于具有相似特異性的現有分析，通常必須開發擴增引物和探針。MARVE的簡單性和準確性使其可用于家庭檢測，并且可通過它快速確定已確認序列的變異的流行病學模式，作為下一代測序的補充。這種具有單核苷酸特異性的經濟型且易于開發的診斷方法還可以為患者提供更個性化的治療信息，并使測試能夠更好地滿足特定區域的特定需求，特別是在資源匱乏的環境中。
盡管折紙可以在4°C下使脲酶活性穩定約一個月，但在室溫或更高溫度下延長反應的保存時間將需提高測定的現場條件，無需昂貴的冷鏈配送和冷藏測試套件。每微升400拷貝的病毒RNA檢測限優于橫向流動檢測的典型檢測限，但它不足以檢測所有活動性感染，也無法與RT-qPCR的靈敏度相匹配。可以簡化MARVE以消除其對折紙折疊步驟的需要，以匹配橫向流動分析的易用性。例如，可以將紙基微流控的控制方案與MARVE集成，以開發從RNA樣本到多路復用結果的診斷，無需用戶干預。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41551-022-00907-0#Fig1
延伸閱讀：
《新冠肺炎（COVID-19）診斷技術、廠商及趨勢-2020版》
《RNA疫苗專利全景分析-2021版》
