浙江大學郝翔/韓于冰團隊：三維多色亞十納米分辨率超分辨顯微成像

研究團隊 | 作者

施欣冶、劉文靜 | 編輯

王攀?| 審核

近日，浙江大學光電科學與工程學院郝翔、韓于冰研究員提出了基于有機小分子探針的膨脹-受激輻射損耗顯微術（expansion stimulated emission depletion based on small-molecule organic probes, SMOP-ExSTED），實現了三維多色亞十納米分辨率超分辨成像。研究團隊通過開發新型的小分子熒光探針，解決了膨脹顯微術中熒光標記密度和亮度難題，結合三維自適應STED系統，以納米級分辨率實現了多種亞細胞結構及其相互作用解析。2023年9月25日，該研究成果以“Three-dimensional multi-color optical nanoscopy at sub-10-nm resolution based on small-molecule organic probes”為題以封面文章的形式發表在Cell Reports Methods雜志。

論文截圖

光學超分辨率顯微術在過去的幾十年經歷了飛速發展，并在生命科學、醫藥等領域得到了廣泛應用。與經典超分辨顯微術不同，膨脹顯微術（expansion microscopy, ExM）可以在水凝膠的支撐下，通過對生物標本的物理放大而進行高分辨率成像。原則上，將樣品膨脹與其他超分辨顯微術相結合可能獲得更高的分辨率。然而，對于幾乎所有的超分辨顯微鏡技術而言，分辨率很大程度上取決于光子數（即熒光亮度）；而ExM則會引起單位體積內熒光標記密度和強度的大量損失。這一矛盾使得兩者的直接結合難以突破三維亞10納米分辨率。盡管現有技術傾向于通過抗體（一抗、二抗復合物尺寸約為20 ~ 30 nm）或熒光蛋白（~5 nm）的多次復用來提高標記亮度和密度，但這些標記物的巨大尺寸在較高分辨率時引入了難以接受的標記誤差。

小分子有機探針（small-molecule organic probes, SMOPs）具備較小的尺寸（<1 nm）和更強的熒光亮度，如果應用于ExM，可以實現更高的標記密度，因而有可能進一步提高分辨率。然而，現有的小分子熒光探針還存在兩方面不足，限制了其在膨脹-超分辨顯微成像中的應用：（1）傳統的熒光探針與膨脹顯微術不兼容，會隨著樣品膨脹的過程從水凝膠中脫落；（2）對于大多數探針來說，如何抵抗超分辨成像所需的高強度激光輻射也是極大的挑戰。

浙江大學光電科學與工程學院郝翔、韓于冰研究團隊在前期三維自適應受激輻射損耗顯微鏡（expansion stimulated emission depletion, STED）的研究基礎上，提出新型有機小分子探針設計，同時兼容ExM的樣品制備及STED對熒光亮度、抗漂白能力的要求，解析了微絲纖維、溶酶體、線粒體等多種亞細胞結構的精細分布和空間相互作用，實現了多色三維亞十納米分辨率超分辨成像，為納米級分辨率光學成像實現細胞生物學問題解析提供了新的研究范式。

圖1 探針設計及其與其他標記方法在膨脹顯微術中的性質對比

首先，針對ExM對樣品的特殊要求，研究團隊設計了一類新的模塊化、通用性的SMOP探針構架（圖1A）。此類SMOP至少包含四個部分：（1）識別基團，用以特異性結合目標結構；（2）錨定基團，用以共價結合膨脹水凝膠；（3）熒光染料，發出熒光信號；（4）連接基團，用以連接探針其他部分。通過錨定基團的加入，使得SMOP整體在膨脹樣品的處理過程中不會從水凝膠網格中脫落，最終保持足夠的熒光信號。該模塊化的設計還可以靈活選擇不同染料，實現對不同策略的超分辨成像的兼容；同理，通過更改識別基團，可實現不同結構的解析。

研究團隊對比了多種標記方法在膨脹顯微術中的表現（圖1B-1H）。傳統小分子探針可在樣品膨脹前呈現優良的成像質量，但在樣品膨脹后會丟失所有熒光信號?？贵w標記由于尺寸較大、標記密度較低，在樣品膨脹后，熒光信號變得更加不連續。熒光蛋白在膨脹先后均可表現較高的熒光亮度，但由于其表達水平難以控制，會導致較高的胞內背景。而本文所開發的SMOP探針在膨脹前后均可實現微絲樣品結構連續的高亮度、高信噪比成像。

圖2 三維分辨率測定

隨后，團隊將SMOP應用于ExSTED成像中，驗證了SMOP在樣品膨脹之后依然滿足超分辨成像的亮度、抗漂白性能要求，并測定了其三維分辨率（圖2）。結果顯示，該方法可達到橫向約6 nm、軸向約9 nm分辨率，為相應樣品的膨脹顯微-共聚焦成像結果的17倍以上。

圖3 膨脹細胞中的多種亞細胞結構三維重建結果

基于以上結果，團隊進一步驗證了該方法實現不同亞細胞結構成像的普適性（圖3）。在膨脹后的細胞樣品中，隨著成像深度進一步增加，像差也進一步加劇。團隊通過引入自適應光學設置和高數值孔徑（numerical aperture, NA）油浸物鏡來實現像差的校正和分辨率的提升。

圖4 雙色SMOP-ExSTED成像

最后，團隊在微絲-溶酶體和溶酶體-線粒體互作成像中進一步驗證了該方法的多色、三維超分辨成像能力（圖4）。

該研究通過光學、生物學、化學、計算機等多學科融合交叉，實現三維多色亞十納米分辨率的光學超分辨顯微成像，為生命科學、醫學、藥學等領域的研究提供了新的有力工具。