冷凍電鏡（Cryo-EM）已成為在近原子分辨率下可視化生物大分子結構不可或缺的技術，它能夠揭示對理解分子功能至關重要的復雜結構細節。然而，該技術長期面臨的一個重要挑戰是對樣品的苛刻要求。傳統的方法需要生成和純化大量蛋白質，而在這些蛋白質中，最終只有極微量到達電子顯微鏡，其它大部分都會被丟棄。這種低效方法不僅消耗了寶貴的時間和資源，還限制了稀有或難以制備蛋白質的研究。
據麥姆斯咨詢報道，比利時弗拉芒生物技術研究所結構生物學中心的研究人員開發了一種基于微流控的新方法，能夠從極微量起始材料中進行高分辨率Cryo-EM結構測定。相關研究成果以“MISO: microfluidic protein isolation enables single-particle cryo-EM structure determination from a single cell colony”為題發表在Nature Methods期刊上。該研究介紹了一種微流控蛋白質分離（MISO）平臺，其可將蛋白質純化和Cryo-EM網格制備整合為單一簡化的流程。與傳統方法的流程相比，新開發的微流控方法將樣品需求量減少了100至1000倍。
微流控蛋白質分離平臺原理及方法表征
微流控蛋白質分離平臺的微流控芯片設計
微流控蛋白質分離平臺的實驗設置
微流控蛋白質分離平臺通過微型化純化步驟并將其直接整合到微流控芯片上，解決了上述挑戰。這消除了批量制備蛋白質的需求，能夠從極微量初始生物樣本中直接分離并制備。值得注意的是，微流控蛋白質分離平臺可以將粗細胞裂解物通過無縫純化過程，在數小時內將純化蛋白質樣品沉積到Cryo-EM網格上，將通常需要數天或數周的工作量壓縮到一天內完成。這種快速、簡化的工作流不僅可以加快數據獲取，還顯著擴展了可進行Cryo-EM分析的生物材料范圍。
利用微流控蛋白質分離平臺進行Cryo-EM分析
該研究通訊作者Rouslan Efremov教授強調了這一成果的變革性本質：“微流控蛋白質分離平臺從根本上拓展了結構生物學的研究邊界。它使研究人員能夠從原始生物材料，甚至單個細胞群落，在一天之內獲得詳細的近原子分辨率結構，并且，僅需傳統所需蛋白質的一個零頭。”這凸顯了該技術對從基礎生物化學到藥物發現等領域的深遠影響，快速、資源高效的結構測定可以加速理解和治療創新。
微流控蛋白質分離系統的魯棒性已在多種蛋白質類別中得到驗證。該團隊成功解析了可溶性酶和膜蛋白的高保真Cryo-EM結構。其中，一項標志性成果涉及從單個大腸桿菌菌落衍生的生物質中純化并確定β-半乳糖苷酶的結構。同樣令人印象深刻的是，研究人員利用相當于一半哺乳動物細胞培養皿的材料，對質子激活的氯離子通道TMEM206這一膜蛋白進行了表征，這展示了該方法極高的靈敏度和效率。
利用微流控蛋白質分離平臺對TMEM206-YFP進行處理和表征
該研究第一作者Gangadhar Eluru博士表示：“這代表了使Cryo-EM技術更加普及和高效所邁出的重要一步。對于許多研究而言，挑戰不在于顯微鏡技術，而在于獲得足夠的高質量蛋白。微流控蛋白質分離平臺直接解決了這一挑戰。”
重要的是，微流控蛋白質分離平臺的用途不僅限于結構解析，它有望成為蛋白質組學和膜蛋白生物學中強大的發現工具。研究人員從Cryo-EM密度圖中直接鑒定了一種未知膜蛋白，并通過微流控蛋白質分離平臺工作流程進行純化，展示了該平臺揭示低豐度或先前未研究的大分子復合物的潛力，且無需繁瑣的樣品制備。這種能力有望徹底變革難以捕獲生物分子的表征，加速分子和細胞生物學的發現進程。
隨著結構生物學與轉化醫學的日益交叉融合，能夠使用極少量生物樣本進行分析的能力，進一步擴展了Cryo-EM技術在稀有或珍貴樣本（例如原代細胞、類器官或臨床活檢樣本）中的應用范圍。
微流控蛋白質分離平臺的技術核心是利用微流控領域的技術進步，在芯片上集成親和純化步驟，隨后將蛋白質樣品控制沉積到Cryo-EM網格上。這種精密的流程確保了蛋白質的完整性和均一性，這是進行準確單粒子分析的關鍵。微流控環境還最小化了樣品的損失和污染風險，提高了重現性和一致性。
展望未來，研究團隊設想進一步改進和縮小微流控蛋白質分離平臺，進而將Cryo-EM技術的應用范圍推向目前無法企及的領域，例如從單個細胞或小型類器官進行常規結構測定，從而為結構細胞生物學和個性化醫療開辟新視野。從生物生理相關環境中捕捉分子結構信息的潛力，能夠以前所未有的廣度和細節加深我們對健康和疾病的理解。
微流控技術與Cryo-EM技術相結合，將結構生物學和生物工程多年的創新成果凝聚成一種簡潔高效的工作流。通過簡化和縮小蛋白質分離和網格制備過程，微流控蛋白質分離平臺不僅加速了科學研究的效率，還使尖端結構分析工具更加普及，使全球實驗室能夠以前所未有的精確度和效率探究生命的分子基礎。
總之，微流控蛋白質分離平臺代表了Cryo-EM技術的重大進步，克服了與樣品數量和制備時間相關的關鍵限制。通過結合微流控蛋白質分離和直接網格制備，它改變了蛋白質結構分析的傳統范式，為有限生物材料所能實現的研究設定了新標準。隨著這項技術的普及，它有望催化分子和結構生物學的新時代，革新對細胞基本機制的研究，加速生命科學領域的發現進程。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41592-025-02894-x
延伸閱讀：
《微流控技術及市場-2024版》
《DNA測序技術及市場-2022版》
