基因芯片技術(shù)是生物芯片的一種，它是生命科學領(lǐng)域里興起的一項高新技術(shù)，它集成了微電子制造技術(shù)、激光掃描技術(shù)、分子生物學、物理和化學等先進技術(shù)。
生物芯片
生物芯片是指將成千上萬的靶分子（比如DNA、RNA或蛋白質(zhì)等）經(jīng)過一定的方法有序地固化在面積較小的支持物（如玻璃片、硅片、尼龍膜等）上，組成密集分子排列，然后將已經(jīng)標記的樣品與支持物上的靶分子進行雜交，經(jīng)洗脫、激光掃描后，運用計算機將所得的信號進行自動化分析。
這種方法不僅節(jié)約了試劑與樣品，而且節(jié)省了大量的人力、物力與時間，使檢測更為快速、準確、敏感，是目前生物檢測中效率高、最為敏感和最具前途的技術(shù)。根據(jù)在支持物上所固定的靶分子的種類可將生物芯片分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片和芯片實驗室等。目前，技術(shù)比較成熟、應用最廣泛的是基因芯片技術(shù)，其在基因組的表達分析、藥物篩選、模擬生物的基因表達及功能研究、遺傳疾病基因診斷、病原微生物的診斷等方面都有廣泛的應用，是一種高效、大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段。
基因芯片
基因芯片也稱DNA微陣列,是生物芯片的一種。基因芯片原理最初是由核酸的分子雜交衍生而來的,即應用已知序列的核酸探針對未知序列的核酸序列進行雜交檢測DNA芯片技術(shù)，實際上就是一種大規(guī)模集成的固相雜交。是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接將大量預先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交。通過計算機對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達的信息)。由于常計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。
基因芯片采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地固定于與光電測量裝置相結(jié)合的硅片、玻璃片、塑料片或尼龍基底等固體支持物上，形成二維陣列，與待測的標記樣品的基因按堿基對配對原理進行雜交，從而檢測特定基因。
基因探針利用核糖雙鏈的互補堿基之間的氫鍵作用形成穩(wěn)定的雙鍵結(jié)構(gòu)，通過測量目的基因上的光電信號來實現(xiàn)對樣品的檢測，從而使基因芯片技術(shù)成為高效的大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段。
基因芯片技術(shù)原理
1、DNA探針的大量收集和純化，基因芯片探針制備方法可以是根據(jù)基因設計特異性的PCR引物，對基因進行特異性地擴張，也可以是建立均一化的cDNA文庫，通過克隆鑒定、篩選、擴增產(chǎn)生；
2、將純化后的探針固定在片基上，首先要將基片（主要用的是玻璃片）進行特殊的化學處理，使玻璃片醛基化或氨基化，然后將純化的探針通過顯微打印或噴打在基片上，再將打印好的玻璃片進行后處理，如水合化、加熱或紫外交聯(lián)等；
3、樣品的標記，標記的方法一般是采用逆轉(zhuǎn)錄法或隨機引物延伸法等；
4、雜交后芯片的掃描、圖像處理的采集和數(shù)據(jù)分析。
電子芯片（左）與基因芯片（右）比較
基因芯片的特點
1、高通量、多參數(shù)同步分析。目前基因芯片制作工藝可達到在1cm2的載體平面上固定數(shù)萬至數(shù)十萬的探針，可對樣品中數(shù)量巨大的相關(guān)基因，甚至整個基因組及信息進行同步檢測和分析。
2、快速全自動分析。在一定的條件下使樣品中的靶基因片段同時與芯片的多個探針進行雜交，并采用掃描儀器測量雜交信號和分析處理數(shù)據(jù)。從而，從根本上提高了測量工作的速度和效率，也極大降低了測量工作的強度和難度。
3、高精確度分析。由于芯片上的每一點，即每個探針都可以精確定位和選址，加上每個探針都可以精確設計及制備，因此可以精確檢測出不同的靶基因、同一靶基因不同的狀態(tài)以及在一個堿基上的差別。
4、高精密度分析。商品化芯片制作上的精密及檢測試劑和方法上的統(tǒng)一在一定程度上保證了芯片檢測的高精密度和重現(xiàn)性，使不同批次乃至不同實驗室之間的檢測結(jié)果，可以進行有效比對及分析。
5、高靈敏度分析。基因芯片選用了不易產(chǎn)生擴散作用的載體，探針及樣品靶基因的的雜交點非常集中，加上雜交前樣品靶基因的擴增和雜交后檢測信號的擴張，極大地提高了檢測的靈敏度，可以檢測出1個細胞中低至1個拷貝的靶基因，從而使檢測所需的樣品量大幅度減少，一般只需要10～20μL樣品。
基因芯片的分類
基因芯片類型較為繁多，可以依據(jù)不同的分類方法進行分類，一般可分為以下幾種：
1、按照載體上所添加DNA種類的不同，基因芯片可分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩種：寡核苷酸芯片一般以原位合成的方法固定到載體上，具有密集程度高、可合成任意系列的寡核苷酸等優(yōu)點，適用于DNA序列測定、突變檢測、SNP分析等；其缺點是合成寡核苷酸的長度有限，因而特異性較差，而且隨著長度的增加，合成錯誤率增加。寡核苷酸芯片也可通過預合成點樣制備，但固定率不如cDNA芯片高，寡核苷酸芯片主要用于點突變檢測和測序，也可用作表達譜研究。cDNA芯片是將微量的cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，其基因點樣密度雖不及原位合成寡核苷酸芯片高，但比用傳統(tǒng)載體的點樣密度要高得多，cDNA芯片最大的優(yōu)點是靶基因檢測特異性非常好，主要用于表達譜研究。
2、按照載體材料分類：載體材料可分為無機材料和有機材料兩種，無機材料有玻璃、硅片、陶瓷等，有機材料由有機膜、凝膠等。膜芯片的介質(zhì)主要采用的是尼龍膜，其陣列密度比較低，用到的探針量較大，檢測的方法主要是用放射性同位素的方法，檢測的結(jié)果是一種單色的結(jié)果。而以玻璃為介質(zhì)的芯片，陣列密度高，所用的探針量少，檢測方法具有多樣性，所得結(jié)果是一種彩色的結(jié)果，與膜芯片相比，結(jié)果分辨率更高一些，分析的靈活性更強。
3、按照點樣方式的不同可以分為原位合成芯片、微矩陣芯片、電定位芯片三種。
基因芯片制備技術(shù)
傳統(tǒng)制備技術(shù)
由于芯片種類較多，其制備方法也不盡相同，傳統(tǒng)的制備方法基本可分為兩類：一類是原位合成，另一類是直接點樣。原位合成是用于寡氨基酸，直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸甚至mRNA。原位合成主要有光刻法和壓電打印法兩種途徑。
1. 原味光刻合成
其利用固相化學、光敏保護基及光刻技術(shù)得到位置確定、高度多樣化的化合物集合。合成的第一步是利用光照射，使固體表面上的羥基脫保護，然后固體表面與光敏保護基保護的、亞磷酰胺活化的堿基單體接觸，使一個核苷酸單體連接上去，合成只在那些脫去保護基的地方發(fā)生，這個過程反復進行直至合成完畢。這個方法最大的優(yōu)點就是在一個較小的區(qū)域，可制造大量不同的探針。但是這種制備方法需要預選設計，制造一系列掩蓋物，造價較高，制造過程中采用光脫保護方法，掩蓋物孔徑較小時會發(fā)生光衍射現(xiàn)象，制約了探針密度的進一步提高。
2. 原味打印合成
此原理與油墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基的液體而不是碳粉，噴印頭可在整個芯片上移動，并根據(jù)芯片上不同位點探針序列的需要，將特定的堿基噴印在芯片上的特定位置。該技術(shù)采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學試劑。
3. 分子印章原位合成
其合成原理類似于傳統(tǒng)的印章，其表面按照陣列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此將不同的核酸或多肽合成試劑按印到芯片片基特定的位點，然后進行合成反應。
4. 點樣法
與原位合成法比較，點樣法較為簡單，只需將預先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點樣于經(jīng)原位特殊處理的玻璃片或其他材料上。即其樣品可以事先純化，交聯(lián)的方式多樣；而且可以通過調(diào)節(jié)探針的濃度使不同堿基組成的探針雜交信號一致，研究者可以方便地設計、制備符合自己需要的基因芯片。但是芯片的這種制備過程中，樣品浪費較為嚴重，對寡核苷酸的化學修飾也會增加合成成本，而且芯片制備前需要儲存大量樣品。
新的制備技術(shù)
1. 微電子芯片
利用微電子工業(yè)常用的光刻技術(shù)，芯片被設計構(gòu)建在硅/二氧化硅等基底材料上，如圖2所示，經(jīng)熱氧化，制成1mm×1mm的陣列，每個陣列含有多個微電極，在每個電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場作用下生物素標記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點是雜交速度快，可大大縮短分析時間，但制備復雜、成本高。
2. 三維生物芯片
這種芯片技術(shù)主要是利用官能團化的聚丙酰氨凝膠塊作為基質(zhì)來固定寡氨基酸。通常的制備方法是將有活性基團的物質(zhì)或丙烯酰胺衍生物與丙烯酰胺單體在玻璃板上聚合，機械切割出三維凝膠微塊，使每塊玻璃片上有10 000個微小的聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用于靶DNA、RNA或蛋白質(zhì)的分析，光刻或激光蒸發(fā)除去凝膠塊之間的凝膠，再將帶有活性基團（氨基、醛基等）的DNA點，加到凝膠上進行交聯(lián)，再將DNA樣品轉(zhuǎn)移到凝膠塊上。
3. 流過式芯片
即在芯片片基上制成格柵狀微通道，設計及合成特定的寡氨基酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片特定區(qū)域。從待檢測樣品中分離DNA或RNA，并對其進行熒光標記，然后該樣品流過芯片，固定的寡氨基酸探針捕獲與之相互補的核酸，再用信號檢測系統(tǒng)分析結(jié)果。其特點是敏感度高、速度快、價格較低。
當前主要幾種基因芯片技術(shù)
光引導原位合成技術(shù)生產(chǎn)寡聚核苷酸微陣列
開發(fā)并掌握這一技術(shù)的是Affymetrix公司，Affymetrix采用了照相平板印刷技術(shù)技術(shù)結(jié)合光引導原位寡聚核苷酸合成技術(shù)制作DNA芯片，生產(chǎn)過程同電子芯片的生產(chǎn)過程十分相似。采用這種技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片可以達到1×106/cm2的微探針排列密度，能夠在一片1厘米多見方的片基上排列幾百萬個寡聚核苷酸探針。
原位合成法主要為光引導聚合技術(shù)（Light-directed synthesis），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導聚合技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。半導體技術(shù)中曾使用照相平板技術(shù)法在半導體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術(shù)是當前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術(shù)成熟且已實現(xiàn)自動化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽列陣提供了一條快捷的途徑。
Affymetrix公司已有診斷用基因芯片成品上市，根據(jù)用途可以分為三大類，分別為基因表達芯片、基因多態(tài)性分析芯片和疾病診斷芯片，基因表達分析芯片和基因多態(tài)性分析芯片主要用于研究機構(gòu)和生物制藥公司，可以用來尋找新基因、基因測序、疾病基因研究、基因制藥研究、新藥篩選等許多領(lǐng)域，Affymetrix公司主要生產(chǎn)通用寡聚核苷酸芯片；疾病診斷芯片則主要用于醫(yī)學臨床診斷，包括各種遺傳病和腫瘤等，目前Affymetrix公司生產(chǎn)三種商品化診斷芯片，分別為p53基因突變診斷芯片、艾滋病病毒基因基因突變診斷芯片和細胞色素P450基因突變診斷芯片。
微電子芯片
Nanogen開發(fā)了多位點電控陣列并含獨立可尋址檢測區(qū)域的微電子基因芯片，其基質(zhì)全部以硅、鍺與基礎(chǔ)的半導體材料，在其上構(gòu)建25-400個微鉑電極位點，各位點可由計算機獨立或組合控制。無論在芯片制造或成品芯片檢測，均可通過相似微電極的電場變化來使核酸結(jié)合，引入“電子嚴謹度”參數(shù)使芯片檢測通過靶、探針序列特征和使用者要求來控制雜交過程中的嚴格性。這種微電子基因芯片具有以下優(yōu)點：
1．電場定位過程能選擇性地轉(zhuǎn)運帶電荷DNA分子，通過每個微電極位點的電場正負、強弱變化，能準確有效地隨意調(diào)控芯片表面的核酸，既可將核酸結(jié)合在微電極位點上，也可以使核酸轉(zhuǎn)運出來。
2．通過電場變化能加快DNA雜交速率，通過導入正電場后，可以大大加快待測核酸同已知探針的結(jié)合速率，減少了雜交反應時間，同普通的“被動”雜交反應的幾小時相比，這種“主動”雜交反應僅僅幾秒鐘就可完成。另外電場變化又可有效地去除未結(jié)合游離分子，減少未結(jié)合熒光信號干擾。
3．通過電子嚴謹度可有效地控制雜交過程中的錯配度，雜交錯配的程度，對不同的要求上要給以不同的電場就可以符合不同的電子嚴謹度，這對核酸雜交嚴格度可以非常靈活地控制，這可以非常準確地進行SNP檢測。
微量點樣技術(shù)
目前大部分生產(chǎn)基因芯片的公司都是使用這一方法，采用了先進更加微量的點樣技術(shù)，可以點更加微量的探針。這種方法生產(chǎn)的芯片上探針不受探針分子大小種類的限制，能夠靈活機動地根據(jù)使用者的要求制作出符合目的的芯片。由于同時有生產(chǎn)和檢測儀器出售，使擁護能夠根據(jù)自己的需要制作相應的芯片，并且價格較低，所以近期內(nèi)國內(nèi)將會有一定的市場。生產(chǎn)這種設備的公司有很多，象美國的Genomicsolutions公司、英國的BioRobotics公司、美國的Cartesian公司和加拿大的Engineering公司等。
對于微量點樣技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片來說從儀器組成上可以分為點樣儀器、雜交裝置、檢測儀器和分析儀器，點樣儀器是否先進決定芯片上的探針密度和結(jié)合牢固程度，雖然芯片的探針密度是一個很重要的指標，達到極高密度的探針陣列是許多芯片生產(chǎn)公司夢寐以求的目標，但是具體的點樣密度根據(jù)使用者的目的來決定，而且還要考慮到隨后的雜交和檢測過程。衡量點樣裝置有幾個比較重要的指標，如儀器整體設計、功能多樣性、芯片基質(zhì)多樣性、點樣穩(wěn)定性、點樣速度、點樣密度等等。
點陣器一般采用實心或空心點樣針，點樣方式有非接觸噴點（inkjet printing）和接觸點樣（Contact printing）兩種方式。目前，有兩種非接觸噴點技術(shù)用于DNA點樣，一種是用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術(shù)（piezoelectric technology），噴滴大小一般為50-500pl；另一種為注射器螺線管技術(shù)（syringe-solenoid technology），這種技術(shù)是通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機結(jié)合起來精確控制滴液的。
檢測儀器也是一個重要的限制條件，如果檢測儀器的分辨率不高，那么即使點樣儀器制造出了很高密度的芯片也沒有用，對高密度的芯片通常使用激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻CCD，二者各有利弊，須根據(jù)要求綜合衡量。
顯色和分析測定方法主要為熒光法，目前正在發(fā)展的方法有質(zhì)譜法、化學發(fā)光法、光導纖維法等。以熒光法為例，當前主要的檢測手段是激光共聚焦顯微掃描技術(shù)和高性能的冷卻CCD，以便于對高密度探針陣列每個位點的熒光強度進行定量分析。因為探針與樣品完全正常配對時所產(chǎn)生的熒光信號強度是具有單個或兩個錯配堿基探針的5-35倍，所以對熒光信號強度精確測定是實現(xiàn)檢測特異性的基礎(chǔ)。
分析儀器從硬件上說只是一部高性能的計算機，但其中最重要的是分析軟件，如果只是進行簡單的檢測或科學實驗，待測樣品所要分析的基因很少很簡單，采用直觀的觀察就可以得出結(jié)論，但對于大量的基因分析或是臨床檢驗人員使用就需要有全面智能化的分析軟件輔助，這樣還需要考慮到軟件的升級。
其他技術(shù)
主要是美國NIH、Caliper公司和Orchidbio公司等，Orchidbio公司研制了一種毛細管微流泵芯片，在邊長2英寸的芯片上集成了144個微室，分別由流入孔、反應室、循環(huán)管和廢液流出孔組成，這種芯片不但可以用于基因診斷和分析，還可用于合成化學，利用芯片的微指結(jié)構(gòu)，Caliper公司的芯片可以用作細胞分選器，能夠利用血細胞體積和變形性等特點可以很容易地把紅細胞和白細胞分開，NIH研制微型芯片反應器可以很快地完成一系列生化反應。
基因芯片技術(shù)應用領(lǐng)域
科研領(lǐng)域
1998年底美國科學促進會將基因芯片技術(shù)列為1998年度自然科學領(lǐng)域十大進展之一，足見其在科學史上的意義。它以其可同時、快速、準確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。
這些應用主要包括基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。采用基因芯片檢測基因表達的改變能夠節(jié)省大量的人力物力和財力，在以前，科學家不得不重復大量的實驗來觀察多個基因的改變情況，如果采用傳統(tǒng)的方法研究細胞中的上千個基因的改變幾乎是不可想象的，因為必須提取首先提取細胞的核酸，而且要足夠多以滿足Northern雜交的需要，然后標記每一種探針，再分別進行雜交檢測。
而采用基因芯片則可以使工作量成千上萬倍地減少，利用基因芯片同時檢測了酵母菌中6000個基因的功能，而斯坦福大學Patrick Brown領(lǐng)導的科研小組則成果地檢測了人成纖維細胞中8600個基因的表達改變。基因芯片黑可用于基因測序，目前美國人類基因組計劃正在大力發(fā)展這一技術(shù)爭取能替代目前的自動測序，同現(xiàn)有的手工測序和自動測序相比，基因芯片測序能節(jié)省大量的試劑和儀器損耗。在基因表達檢測的研究上人們已比較成功地對多種生物包括擬南芥、酵母及人的基因組表達情況進行了研究。
實踐證明基因芯片技術(shù)也可用于核酸突變的檢測及基因組多態(tài)性的分析，與常規(guī)測序結(jié)果一致性達到98%等的突變檢測，對人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型、人線粒體基因組多態(tài)性的研究等。將生物傳感器與芯片技術(shù)相結(jié)合，通過改變探針陣列區(qū)域的電場強度已經(jīng)證明可以檢測到基因的單堿基突變，通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖。
雜交測序是基因芯片技術(shù)的另一重要應用。該測序技術(shù)理論上不失為一種高效可行的測序方法，但需通過大量重疊序列探針與目的分子的雜交方可推導出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探針。基因芯片技術(shù)可以比較容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的問世無疑為雜交測序提供了實踐的可能性。
生物制藥領(lǐng)域
各大藥廠和生物技術(shù)公司將會使用基因芯片發(fā)現(xiàn)篩選新藥等。采用基因芯片技術(shù)，可以大大加快人類基因組計劃的工作進度，例如用于基因測序、基因表達檢測和新的遺傳標志如SNP定位等，這對尋找新的功能基因、尋找新的藥物作用靶點和開發(fā)新的基因藥物具有重要意義。采用基因芯片可以進行超乎以前想象的工作量來檢測不同物種、不同組織、不同病種、不同處理條件下的基因表達改變，從而知道開發(fā)具有不同用途的的診斷試劑盒。新藥在實驗階段必須通過人體安全性實驗，就必須觀察藥物對人基因表達的影響，由于并不知道藥物對那一種基因起作用，就必須對已知所有或一定范圍內(nèi)的基因表達都進行檢測，采用基因芯片可以迅速而準確地完成這一任務，美國Tularick公司曾開發(fā)出一種用于新藥，能夠顯著地降低低密度脂蛋白-一種能引起血管硬化的物質(zhì)，隨后Tularick公司的科研人員采用Syntini公司的基因芯片研究了這種新藥對人體細胞基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)它能顯著地改變細胞的基因表達圖譜，十分類似有又一種毒性反應，Tularick公司只好終止了這種藥物的研發(fā)，由此公司節(jié)省了大量的投資。
醫(yī)學診斷
1、在優(yōu)生方面，目前知道有600多種遺傳疾病與基因有關(guān)。婦女在妊娠早期用DNA芯片做基因診斷，可以避免許多遺傳疾病的發(fā)生。
2、在疾病診斷方面，由于大部分疾病與基因有關(guān)，而且往往與多基因有關(guān)，因而，利用DNA芯片可以尋找基因與疾病的相關(guān)性，從而研制出相應的藥物和提出新的治療方法。DNA芯片的高密度信息量和并行處理器的優(yōu)點不僅使多基因分析成為可能，而且保證了診斷的高效、廉價、快速和簡便。
3、應用于器官移植、組織移植、細胞移植方面的基因配型，如HLA分型。
4、病原體診斷，如細菌和病毒鑒定、耐藥基因的鑒定。
5、在環(huán)境對人體的影響方面，已知花粉過敏等人體對環(huán)境的反應都與基因有關(guān)。若對與環(huán)境污染相關(guān)的200多個基因進行全面監(jiān)測，將對生態(tài)環(huán)境控制及人類健康有重要意義。
6、在法醫(yī)學方面，DNA芯片比早先的DNA指紋鑒定更進一步，它不僅可做基因鑒定，而且可以通過DNA中包含的生命信息描繪生命體的臉型長相外貌特征。這種檢驗常用于災難事故后鑒定尸體身份以及鑒定父母和子女之間的血緣關(guān)系。
由此可見，利用DNA芯片可以快速高效地獲取空前規(guī)模的生命信息，這一特征將使DNA芯片技術(shù)成為今后科學探索和醫(yī)學診斷等諸多方面的革命性的新方法、新工具。
- END -
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